定量与质量控制：高通量测序（NGS）应用细胞游离 DNA（cfDNA）分析的关键考量
准确的 cfDNA定量是成功执行 NGS流程的关键。本篇文章说明如何运用高灵敏与特异性的 EzCube荧光定量仪来强化样本质量控管，并提供将 EzCube与 EzDrop超微量分光光度计整合至 cfDNA样本前处理和测序准备流程中的实用建议。。
细胞游离 DNA（cfDNA）于高通量测序 （NGS）中展现出高度潜力，特别是在癌症精准医学领域。由于其具备无创与实时监测的特性，使其成为肿瘤分子分析的重要工具。 cfDNA可克服肿瘤异质性问题，提供较传统组织切片更全面的肿瘤基因体信息；当组织样本稀少或难取得时，cfDNA亦可作为替代选项，大幅提升可采取治疗行动的基因变异的检出率。
然而，cfDNA的分析程序面临许多挑战，像是肿瘤 DNA（ctDNA）于整体 cfDNA中的比例极少（仅约 0.01％-10％）。于技术层面，cfDNA样本浓度可能极低且有高污染风险。 为了应对这些挑战，研究强调需要严谨的定量和质量控制（QC）以支持其在临床实务中更广泛的采用。
为什么 cfDNA NGS要更高标准的定量和质量控制呢？
当执行 cfDNA的 NGS分析时，严格的定量与质量控制标准至关重要，主要原因在于 cfDNA本身的特殊性质与技术挑战。血浆中的 cfDNA含量极低（通常为 2-10 ng／mL），且短片段容易降解。若在NGS流程中无法准确控制样本质量，可能出现以下问题：
- 建库失败：由于 cfDNA不足，建库阶段可能会失败，造成后续聚合酶连锁反应（PCR）扩增无法进行。
- 定量误差：定量不准确将导致建库浓度估算出现偏差。基于 cfDNA于大量的背景 DNA中浓度极低（小于 1 ng／μL），此类误差可能造成测序过程中覆盖过高或不足。
- 数据偏差：约 166bp片段型态对于质量评估非常重要。若样本中存在高分子量基因组 DNA（gDNA大于 800bp）或其他杂质，将会严重影响测序比对 （mapping）效率与重复率，导致数据偏差。
为了克服上述难题，cfDNA的 NGS流程必须具备极高的灵敏度和再现性。不仅要能准确定量极少量的核酸，还必须能侦测样本降解与污染，以确保测序数据的最高质量。传统分光光度法虽然简易、快速，可以提供样本总浓度和纯度的初步评估，但面对像 cfDNA这类对杂质极为敏感的低浓度样本时，其灵敏度与特异性往往不足。
因此，在研究和临床实验室中，越来越倾向采用更精密的检测方法，尤其是搭配高灵敏度和高准确度的荧光定量仪（如 EzCube）。此类仪器不仅可准确定量极低浓度的 cfDNA，还能有效评估样本完整性，为后续NGS建库与测序提供可靠的质控，确保实验结果的准确性与再现性。
EzCube荧光定量仪如何支持精确地处理 cfDNA？
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高灵敏度与准确性：
EzCube荧光定量仪使用荧光染剂特异性与 DNA／RNA结合，可处理极低浓度的样本。在样本仅每毫升数皮克的浓度中，仍能呈现高度准确且可重复的结果。特别适合用于 NGS实验中的样本质量检测。
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DNA/RNA的特异性检测：
如上所述，若样本前处理过程中使用了较复杂的试剂，可能会干扰检测反应。然而荧光法中使用的荧光染剂仅与 DNA或 RNA结合，结果不会受到蛋白质、盐类或其他污染物的影响，因此能更准确反映样本中 DNA/RNA的实际浓度。这种特异性有助于提高 NGS样本质控中定量检测的可靠性。
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简便快速的操作：
EzCube荧光定量仪操作简便，只需将样本与荧光染剂混合后放入仪器，数秒内即可取得结果。即使是极低浓度的样本，也能获得非常准确且可靠的定量结果。高效率和便利的特性，使 EzCube荧光定量仪成为 NGS工作流程中检测样本质量的实用选择。
双重质控：EzCube与 EzDrop的黄金组合
样本前处理阶段，仅靠单一仪器可能无法确保完美且快速地评估样本浓度和纯度。然而， EzDrop与 EzCube的组合能为后续结果提供全面且可靠的支持：
- EzDrop超微量分光光度计：一款快速、简单且经济实惠的核酸／蛋白定量工具，无需试剂即可检测高浓度样本（如双链 DNA 2-20,000 ng／μL），适用于初步定量与纯度分析，并可检测污染，这是样本质控的关键（请见下表）
- EzCube荧光定量仪：具备极高灵敏度（最低可测至 0.01 ng／μL）与特异性，可区分不同类型的核酸（双链 DNA／单链 DNA／RNA）。需搭配使用的荧光试剂，是专为微量检测与高精准实验（如 NGS、qPCR）所设计。
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质控功能 |
EzDrop超微量分光光度计 |
EzCube荧光定量仪 |
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快速浓度检测 |
★ 实时检测，无需试剂 |
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精准双链 DNA定量 |
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★ 高特异性 |
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纯度评估（A260／280 & A260／A230） |
★ 检测污染物 （如蛋白质、溶剂） |
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低浓度检测 |
- 可靠性有限（高变异性） |
★ 高灵敏度（低检测极限） |
表格： EzDrop 与 EzCube 的组合提供了完整的样本定量解决方案。
EzDrop与 EzCube的组合提供了完整的样本定量解决方案。两者可测量样本的总量、纯度和有效浓度，有助于降低 NGS失败率，是 cfDNA样本前处理流程的理想组合。
延伸阅读：
实验建议：cfDNA液体活检流程的应用指南
若您正在进行 cfDNA相关的 NGS研究，建议采用以下样本质控流程，以提高实验成功率和数据质量：
- 使用 EzDrop超微量分光光度计，测量样本于 260nm波长的吸光值以评估核酸浓度，同时测量 A260／A280和A260／A230的纯度比值，确保样本质量符合后续实验需求。
- 使用 EzCube荧光定量仪搭配不同类型的 EzQuant试剂，可准确定量双链 DNA浓度，确保样本达到建库所需的起始量。此方法具有皮克级的高灵敏度，能有效区分恶性样本与正常样本之间的浓度差异。
- 建库完成后，应使用毛细管电泳系统分析片段分布，必要时可透过 qPCR验证有效浓度，以确保测序质量。
此建议流程可应用于各种 cfDNA研究环境，为测序前质控提供结构化的方法。
精准定量奠定 NGS品质基础
cfDNA样本蕴含丰富的生物标记潜力，但分析过程充满挑战。为了获得可靠的高通量测序结果，严格的定量工具和质控极为重要。EzCube荧光定量仪凭借皮克级的检测灵敏度和卓越的特异性，已成为低浓度 cfDNA研究的关键工具；而 EzDrop超微量分光光度计可快速评估样本的纯度和总量，两者相辅相成，建构完整的质控机制。
无论在基础研究或临床检测中，样本前处理阶段的严格控制对确保后续 NGS数据的可靠性至关重要。透过将精准定量与稳健的纯度评估相结合，不仅可提升再现性，更能有效降低建库失败率和测序成本。
延伸阅读：
参考文献
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