伤口愈合试验的活细胞影像观测再进化

文章来源：岑祥公司

细胞迁移（cell migration）泛指细胞由一个位置移动到另一个位置的过程，是反应细胞在该环境下所遇到的狀态。当细胞迁移至其他的位置，后续可能会发展成新的组织，尤其是当创伤发生或是体内发生发炎反应时，就会产生显著的细胞迁移效应，这是为了修补伤口并避免感染。皮肤表面产生伤口时，伤口会触发讯号，刺激周围的纤维细胞增生及迁移至伤口处进行修復。伤口产生也可能被微生物感染而产生伤口周围的发炎反应，发炎的区域会释放出特殊的讯号吸引免疫细胞往发炎处移动，并针对感染原进行吞噬、溶解等免疫反应。当然除了正常的细胞迁移之外，癌细胞也可能透过细胞迁移離开原发器官转移到其他的位置，进而产生了恶性转移(Metastasis) 。

伤口愈合试验(Wound-healing assay) 便是观察细胞迁移(Cell migration) 的典型试验之一。传统的伤口愈合试验是将细胞先养在盘上达约90%后，以tip等硬物直接在盘上画出数道没有细胞的区域，并以显微镜观察这些区域边缘细胞的生长。但是以手动方式画出的区域难以维持稳定的范围，且对于细胞也会先造成部分伤害。而后便又发展出了固定细胞生长区域的insert ，等细胞长满insert内部后将insert取走便有大小固定的无细胞区供细胞生长。

图一、典型的伤口愈合试验

但不管是哪一种方式培养细胞，我们都必须将养在培养箱中的细胞不停地取出到外部以显微镜观察并纪录。如此频繁的进出培养箱将造成观测的样本不停遭受环境变化，反而造成细胞本身的压力致使实验误差。更甚者，频繁的开关培养箱也会造成培养箱内的环境不稳定，除了影响自己的实验，也同时影响了其他实验室伙伴的实验，并且提高了污染的风险。

因此，目前观测Wound-healing assay 的主流时间点一般都是在8-12 小时观察一次，这样便可以大幅度的降低环境改变对细胞所造成的影响。虽然细胞的生长速度相对缓慢，但这么长的观察间隔，也造成另一个问题的产生，就是难以捕捉关键时刻。常发生前一次观察时，细胞都还生长的非常旺盛，但下一个时间点就全变了样，而这其间究竟发生了什么事却完全没有纪录下来。而间隔时间过长的另一个缺点就是影像纪录的位置几乎无法固定，每一次拍摄的区域实际上都是不相同的，失去了所谓的『连续性』，也让人有存疑的空间。

为了在进行伤口愈合试验时，希望可以同时满足『即时』又『长时间』观察两种看似截然矛盾的需求，蓝光生物科技公司开发出了新一代的活细胞成像系统。专为培养箱内的高温高湿环境所设计，并大幅缩小显微影像系统的体积，使其可以直接置放在培养箱中，外部连结电脑随时监测箱中细胞的状态。让您无须开启培养箱便可即时观察，同时可依自己的需求设定时间间隔，不错过任何的关键时刻。一套软体可控制四台主机，同时搭配Windows 作业系统，可应用各类远端桌面程式，让你随时都可以掌握细胞状态与实验走向

因应再生医学的蓬勃发展，伤口愈合试验将是观察实验处理对细胞迁移的重要测试。细胞试验逐渐多元化的现今，我们所要求的已经不再只是最终的结果，还必须包含整个过程的变化，因此连续式活细胞观察系统将会是符合目前趋势的最佳解答。

除了伤口愈合试验之外，连续式活细胞观察系统更是适合应用在组织工程的先期分析，以下为EzScope 使用者的体验分享：

脂肪干细胞在明胶组织工程应用之先期分析

• 实验目的本实验室主要为研究方向为软骨组织工程再生，利用生物材料制备3D生物支架，并评估细胞利用3D 生物支架进行组织再生的可行性。不同生物材料所形成的微环境造成细胞状态改变是常见的，因此进行3D 生物支架制备的前驱实验进行初步评估有其必要性。  
• 过程简述明胶( gelatin ) 为主要研究材料，以不同浓度明胶0.1% ~ 10% 于细胞培养盘上coating ，用以后续细胞培养观察。使用细胞为兔子初代培养脂肪干细胞，由纽西兰大白兔皮下脂肪分离培养。利用干细胞对于环境容易反应之特性来观察细胞型态，以及对于明胶层黏附状况… 等。  
• 实验结果
  1. 将细胞置于不同浓度明胶浓度coating培养盘，直接进行连续两次10分钟观察( 每20sec, 共30张) ，主要观察细胞对于明胶层黏附速度。由影片中观察得知，细胞于0.1% gelatin前十分钟即可有细胞贴附以及展开，而同量同浓度细胞置于10 % gelatin 中细胞仍呈现悬浮状态仍未贴盘。细胞对于明胶材料的黏附速度随着浓度增加而降低。
  2. 让脂肪干细胞于不同浓度明胶浓度coating 培养盘培养2 天至细胞满盘。观察同面积下细胞量，以及细胞型态差异。于照片中可观察到于1% 、5% 、10% gelatin 组别细胞量明显大于0.1% ，推测细胞于明胶层中生长速度变快，但细胞型态未有太大改变。
  3. 脂肪干细胞于不同浓度明胶培养，以脂肪细胞分化培养基进行脂肪细胞分化，观察时间4 天。不论细胞是否培养于明胶中均可观察到细胞开始产生油滴，往脂肪细胞正常分化，可以得知明胶并不影响干细胞分化特性。

细胞之原始状态及该活细胞经过实验方法后之照片

兔初代培养脂肪干细胞原始状态:

兔初代培养脂肪干细胞于明胶培养:

干细胞进行分化: 

• 后续研究计划简述

目前实验观察得知明胶对于细胞并无毒性，细胞可以良好生长，适合作为支架生物材料选择。后续将利用明胶制作3D细胞支架，由于生物支架的硬度及弹性也是考量之一，后续研究将进行生物支架的力学物性分析，以找寻最佳浓度进行软骨组织工程再生研究。

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