Table of contents
- 核酸定量的重要性
- 核酸定量方法概览
- 主要核酸定量方法详解
- 如何选择合适的 DNA 定量方法
- 核酸定量方法比较
- 常见问题（FAQ）
- 总结与展望
Table of contents
- 核酸定量的重要性
- 核酸定量方法概览
- 主要核酸定量方法详解
- 如何选择合适的 DNA 定量方法
- 核酸定量方法比较
- 常见问题（FAQ）
- 总结与展望
核酸定量的重要性
在现代分子生物学研究中，核酸定量是不可或缺的步骤。准确的核酸定量对于确保实验结果的可靠性和可重复性至关重要。无论是进行 PCR、基因测序，还是其他分子生物学实验，了解样品中核酸的精确浓度都是成功的关键。
核酸定量的主要作用体现在优化实验条件、评估样品质量、确保下游应用的成功以及节省时间和资源。许多实验要求特定浓度的核酸输入，准确的定量有助于研究人员优化实验条件。通过定量，我们可以评估 DNA 提取和纯化的效率，并检测潜在的污染物。在 NGS（高通量测序）等应用中，准确的核酸定量对文库制备至关重要。此外，精准的定量可避免因核酸浓度不当而导致的实验失败，从而节省宝贵的时间和资源。
鉴于核酸定量的重要性，选择合适的定量方法尤为关键。不同方法各有优缺点，适用于不同的实验场景。
核酸定量方法概览
在进行核酸定量时，研究人员可以选择多种方法。每种方法基于不同的原理，适用于不同的实验需求。主要的核酸定量方法包括 UV-Vis光谱法（分光光度计法）、 荧光法、 实时定量PCR （qPCR）、凝胶电泳法和毛细管电泳法。这些方法各具特点，从简便快捷的UV-Vis法到高精度的 qPCR 法，为研究人员提供了多样化的选择。
主要核酸定量方法详解
1. UV-Vis 光谱法
UV-Vis光谱法是最常用的核酸定量方法之一，以其简便快捷而广受认可。该方法基于核酸在 260 nm 波长处具有最大吸收特性的原理。通过测量样品在该波长的吸光度，可计算核酸浓度。操作步骤包括使用缓冲液校准仪器、测量样品吸光度，并利用公式计算核酸浓度。
UV-Vis法的优势在于快速、操作简便，无需特殊试剂，并可同时评估样品纯度。然而，该方法也存在局限性，例如无法区分 DNA 和 RNA，对低浓度样品的检测灵敏度较低，且易受污染物影响。在常规的质粒 DNA 提取或基因组 DNA 提取后的浓度检测中，UV-Vis 法通常是首选方法。近年来，微量分光光度计的发展成为一大趋势，使得仅需1-2 μL样品即可完成测量，大幅提升了实验效率。
3. 实时定量 PCR （qPCR）
qPCR 是一种结合 PCR 扩增与荧光检测的高灵敏度、高特异性核酸定量方法。该方法通过实时监测 PCR 过程中产生的荧光信号强度来定量初始样品中的核酸含量。操作步骤包括设计特异性引物和探针、制备反应试剂、运行 qPCR 程序，并分析扩增曲线和 Ct 值。
qPCR具有极高的灵敏度和序列特异性，可同时进行定量和定性分析。然而，该方法需要专门的设备和试剂，成本较高，操作相对复杂，且实验耗时较长。在基因表达水平检测、病毒载量定量或极低浓度核酸样品的定量中，qPCR是首选方法。此外，在 FFPE 样本中降解 DNA，qPCR 是最可靠的定量方法。
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4. 凝胶电泳法
凝胶电泳法是一种可视化的核酸定量方法，特别适用于评估核酸的完整性和大小。该方法基于核酸在电场中的迁移速度与其分子量成反比的原理，并通过比较样品与已知浓度的核酸标准品的亮度进行半定量分析。
凝胶电泳法的优势在于可同时评估核酸的浓度、大小和完整性，直观可视化，且无需昂贵的专用设备。然而，该方法仅能进行半定量分析，检测灵敏度较低，且使用有毒染料可能存在安全隐患。在 PCR 产物检测、核酸完整性评估或粗略估算核酸浓度时，凝胶电泳法是一种非常实用的工具。
5.毛细管电泳法
毛细管电泳法是一种自动化程度高、可同时分析核酸浓度和大小的技术。该方法结合了电泳分离与荧光检测技术，通过毛细管中的高分辨率分离来分析核酸。操作步骤包括样品制备与加载、自动进行毛细管电泳分离、荧光检测，以及数据分析和报告生成。
毛毛细管电泳法的优势在于高通量、自动化程度高，可同时提供核酸浓度和片段大小信息。然而，该方法设备昂贵，样品制备较为复杂，对操作人员的技术要求较高。在 NGS 文库质量控制、核酸片段分析或大规模样本筛查中，毛细管电泳法展现出独特优势。
核酸定量方法比较
| 方法 |
灵敏度范围 |
主要优势 | 主要局限性 | 适用场景 |
| UV-Vis 光谱法 |
2-5 ng/μL |
快速、简单、无需特殊试剂 | 无法区分 DNA/RNA，易受污染物影响 | 中高浓度纯样品，快速检测 |
| 荧光法 | 0.1-0.5 ng/μL | 高灵敏度，可区分DNA/RNA | 需要标准曲线，试剂成本较高 | 低浓度样品，需高精确度 |
| qPCR | <0.1 ng/μL | 极高灵敏度，序列特异性 | 设备和试剂昂贵，耗时较长 | 低极低浓度，特定序列检测 |
| 凝胶电泳法 | 1-5 ng/band | 可视化 DNA 大小和完整性 | 半定量，灵敏度低 | 核酸完整性检查，PCR 产物验证 |
| 毛细管电泳法 | 0.1-0.5 ng/μL | 高通量，自动化 | 设备昂贵，样品制备复杂 | 大规模样本分析，NGS 文库定量 |
常见问题（FAQ）
- 不同方法测得的核酸浓度差异较大，应该相信哪个结果？
通常荧光法和qPCR的结果更可靠，特别是对于低浓度样品。UV-Vis 法可能因污染物的干扰而高估浓度。建议对重要样品采用多种方法进行交叉验证。
- 如何提高微量核酸的定量准确性？
使用荧光法或 qPCR，这些方法对低浓度 DNA 更敏感。增加重复测量次数，并考虑使用载体 DNA（carrier DNA）以减少样品损失。确保使用低吸附的离心管和吸头。
- 哪种方法最适合 NGS 文库定量？
qPCR或荧光法最适用于 NGS 文库定量。qPCR可以特异性检测带接头的文库分子，而荧光法则可提供准确的总 DNA 浓度。
- 处理 FFPE 样本时，应选择哪种定量方法？
对于 FFPE样本，qPCR是最可靠的方法。它可以特异性检测完整的核酸片段，避免降解核酸对测量结果的影响。
