準確的 cfDNA定量是成功執行 NGS流程的關鍵。本篇文章說明如何運用高靈敏與特異性的 EzCube螢光定量儀來強化樣本品質控管，並提供將 EzCube與 EzDrop超微量分光光度計整合至 cfDNA前處理和定序準備流程中的實務建議。
Table of contents
- 為什麼 cfDNA NGS需要更高標準的定量和品質控制呢？
- EzCube螢光定量儀如何支援精確地處理cfDNA？
- 雙重品質控制：EzCube與 EzDrop的黃金組合
- 實驗建議：cfDNA液態切片流程的應用指南
- 精準定量奠定 NGS品質基礎
- 參考文獻
Table of contents
- 為什麼 cfDNA NGS需要更高標準的定量和品質控制呢？
- EzCube螢光定量儀如何支援精確地處理cfDNA？
- 雙重品質控制：EzCube與 EzDrop的黃金組合
- 實驗建議：cfDNA液態切片流程的應用指南
- 精準定量奠定 NGS品質基礎
- 參考文獻
然而，cfDNA的分析程序面臨許多挑戰，像是腫瘤 DNA（ctDNA）於整體 cfDNA中的比例極少（僅約 0.01％-10％）。於技術層面，cfDNA樣本濃度可能極低且有高汙染風險。 為了應對這些挑戰，研究強調需要嚴謹的定量和品質控制（QC）以支持其在臨床實務中更廣泛的採用。
為什麼 cfDNA NGS需要更高標準的定量和品質控制呢？
當執行 cfDNA的 NGS分析時，嚴格的定量與品質控制標準至關重要，主要原因在於 cfDNA本身的特殊性質與技術挑戰。血漿中的 cfDNA含量極低（通常為 2-10 ng／mL），且短片段容易降解。若在 NGS流程中無法準確控制樣本品質，可能會出現以下的問題：
- 建庫失敗：由於 cfDNA不足，建庫階段可能會失敗，造成後續聚合酶連鎖反應（PCR）擴增無法進行。
- 定量誤差：定量不準確將導致建庫濃度估算出現偏差。基於 cfDNA於大量的背景 DNA中濃度極低（小於 1 ng／μL），此類誤差可能造成定序過程中覆蓋過度或不足。
- 數據偏差：約 166bp片段型態對於品質評估非常重要。若樣本中存在高分子量基因組 DNA（gDNA大於 800bp）或其他雜質，將會嚴重影響定序比對 （mapping）效率與重複率，導致數據偏差。
為了克服上述難題，cfDNA的 NGS流程必須具備極高的靈敏度和再現性。不僅要能準確定量極少量的核酸，還必須能偵測樣本降解與汙染，以確保定序數據的最高品質。傳統分光光度法雖然簡易、快速，可以提供樣本總濃度和純度的初步評估，但面對像 cfDNA這類對雜質極為敏感的低濃度樣本時，其靈敏度與特異性往往不足。
因此，在研究和臨床實驗室中，越來越傾向採用更精密的檢測方法，尤其是搭配高靈敏度和高準確度的螢光定量儀（如 EzCube）。此類儀器不僅可準確定量極低濃度的 cfDNA，還能有效評估樣本完整性，為後續NGS建庫與定序提供可靠的品質控制，確保實驗結果的準確性與再現性。
EzCube螢光定量儀如何支援精確地處理cfDNA？
- 高靈敏度與準確性：
EzCube螢光定量儀使用螢光染劑特異性與 DNA／RNA結合，可處理極低濃度的樣本。在樣本僅每毫升數皮克的濃度中，仍能呈現高度準確且可重複的結果。特別適合用於 NGS實驗中的樣本品質檢測。
- DNA/RNA的特異性檢測：
如上所述，若樣本前處理過程中使用了較複雜的試劑，可能會干擾檢測反應。然而螢光法中使用的螢光染劑僅與 DNA或 RNA結合，結果不會受到蛋白質、鹽類或其他汙染物的影響，因此能更準確反映樣本中 DNA/ RNA的實際濃度。這種特異性有助於提高 NGS樣本品質控制中定量檢測的可靠性。
- 簡便快速的操作：
EzCube螢光定量儀直覺式的設計操作簡單，只需將樣本與螢光染劑混合後放入儀器，數秒內即可取得結果。即使是極低濃度的樣本，也能獲得非常準確且可靠的定量結果。高效率和便利的特性，使 EzCube螢光定量儀成為 NGS工作流程中檢測樣本品質的實用選擇。
雙重品質控制：EzCube與 EzDrop的黃金組合
樣本前處理階段，僅靠單一儀器可能無法確保完美且快速地評估樣本濃度和純度。然而， EzDrop與 EzCube的組合能為後續結果提供全面且可靠的支援：
- EzDrop超微量分光光度計：一款快速、簡單且經濟實惠的核酸／蛋白定量工具，無需試劑即可檢測高濃度樣本（如雙股 DNA 2-20,000 ng／μL），適用於初步定量與純度分析，並可檢測污染，這是樣本品質控制的關鍵（請見下表）。
- EzCube 螢光定量儀：具備極高靈敏度（最低可測至 0.01 ng／μL）與特異性，可區分不同類型的核酸（雙股 DNA／單股 DNA／RNA）。需搭配使用的螢光試劑，是專為微量檢測與高精準實驗（如 NGS、qPCR）所設計。
| 品質控制功能 | EzDrop 超微量分光光度計 | EzCube 螢光定量儀 |
|---|---|---|
| 快速濃度檢測 | ★ 即時檢測，無需試劑 | - |
| 精準雙股 DNA定量 | - | ★ 高特異性 |
| 純度評估（A260／280 & A260／A230） | ★ 檢測汙染物 （如蛋白質、溶劑） | - |
| 低濃度檢測 | 可靠性有限（高變異性） | ★ 高靈敏度（低檢測極限） |
表格： EzDrop 與 EzCube 的組合提供了完整的樣本定量解決方案。
EzDrop與 EzCube的組合提供了完整的樣本定量解決方案。兩者可測量樣本的總量、純度和有效濃度，有助於降低 NGS失敗率，是 cfDNA前處理流程的理想組合。
實驗建議：cfDNA液態切片流程的應用指南
若您正在進行 cfDNA相關的 NGS研究，建議採用以下樣本品質控制流程，以提高實驗成功率和數據品質：
- 使用 EzDrop微量分光光度計，測量樣本於 260nm波長的吸光值以評估核酸濃度，同時測量 A260／A280和A260／A230的純度比值，確保樣本品質符合後續實驗需求。
- 使用 EzCube螢光定量儀搭配不同類型的 EzQuant試劑，可準確定量雙股 DNA濃度，確保樣本達到建庫所需的起始量。此方法具有皮克級的高靈敏度，能有效區分惡性樣本與正常樣本之間的濃度差異。
- 建庫完成後，應使用毛細管電泳系統分析片段分布，必要時可透過 qPCR驗證有效濃度，以確保定序品質。
此建議流程可應用於各種 cfDNA研究環境，為定序前品質控制提供結構化的方法。
精準定量奠定 NGS品質基礎
cfDNA樣本蘊含豐富的生物標記潛力，但分析過程充滿挑戰。為了獲得可靠的次世代定序結果，嚴格的定量工具和品質控制極為重要。EzCube螢光定量儀憑藉皮克級的檢測靈敏度和卓越的特異性，已成為低濃度 cfDNA研究的關鍵工具；而 EzDrop微量分光光度計可快速評估樣本的純度和總量，兩者相輔相成，建構完整的品質控制機制。無論在基礎研究或臨床檢測中，樣本前處理階段的嚴格控制對確保後續 NGS數據的可靠性至關重要。透過將精準定量與穩健的純度評估相結合，不僅可提升再現性，更能有效降低建庫失敗率和定序成本。
參考文獻
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