準確的 cfDNA定量是成功執行 NGS流程的關鍵。本篇文章說明如何運用高靈敏與特異性的 EzCube螢光定量儀來強化樣本品質控管,並提供將 EzCube與 EzDrop超微量分光光度計整合至 cfDNA前處理和定序準備流程中的實務建議。
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然而,cfDNA的分析程序面臨許多挑戰,像是腫瘤 DNA(ctDNA)於整體 cfDNA中的比例極少(僅約 0.01%-10%)。於技術層面,cfDNA樣本濃度可能極低且有高汙染風險。 為了應對這些挑戰,研究強調需要嚴謹的定量和品質控制(QC)以支持其在臨床實務中更廣泛的採用。
當執行 cfDNA的 NGS分析時,嚴格的定量與品質控制標準至關重要,主要原因在於 cfDNA本身的特殊性質與技術挑戰。血漿中的 cfDNA含量極低(通常為 2-10 ng/mL),且短片段容易降解。若在 NGS流程中無法準確控制樣本品質,可能會出現以下的問題:
為了克服上述難題,cfDNA的 NGS流程必須具備極高的靈敏度和再現性。不僅要能準確定量極少量的核酸,還必須能偵測樣本降解與汙染,以確保定序數據的最高品質。傳統分光光度法雖然簡易、快速,可以提供樣本總濃度和純度的初步評估,但面對像 cfDNA這類對雜質極為敏感的低濃度樣本時,其靈敏度與特異性往往不足。
因此,在研究和臨床實驗室中,越來越傾向採用更精密的檢測方法,尤其是搭配高靈敏度和高準確度的螢光定量儀(如 EzCube)。此類儀器不僅可準確定量極低濃度的 cfDNA,還能有效評估樣本完整性,為後續NGS建庫與定序提供可靠的品質控制,確保實驗結果的準確性與再現性。
EzCube螢光定量儀使用螢光染劑特異性與 DNA/RNA結合,可處理極低濃度的樣本。在樣本僅每毫升數皮克的濃度中,仍能呈現高度準確且可重複的結果。特別適合用於 NGS實驗中的樣本品質檢測。
如上所述,若樣本前處理過程中使用了較複雜的試劑,可能會干擾檢測反應。然而螢光法中使用的螢光染劑僅與 DNA或 RNA結合,結果不會受到蛋白質、鹽類或其他汙染物的影響,因此能更準確反映樣本中 DNA/ RNA的實際濃度。這種特異性有助於提高 NGS樣本品質控制中定量檢測的可靠性。
EzCube螢光定量儀直覺式的設計操作簡單,只需將樣本與螢光染劑混合後放入儀器,數秒內即可取得結果。即使是極低濃度的樣本,也能獲得非常準確且可靠的定量結果。高效率和便利的特性,使 EzCube螢光定量儀成為 NGS工作流程中檢測樣本品質的實用選擇。
樣本前處理階段,僅靠單一儀器可能無法確保完美且快速地評估樣本濃度和純度。然而, EzDrop與 EzCube的組合能為後續結果提供全面且可靠的支援:
品質控制功能 | EzDrop 超微量分光光度計 | EzCube 螢光定量儀 |
---|---|---|
快速濃度檢測 | ★ 即時檢測,無需試劑 | - |
精準雙股 DNA定量 | - | ★ 高特異性 |
純度評估(A260/280 & A260/A230) | ★ 檢測汙染物 (如蛋白質、溶劑) | - |
低濃度檢測 | 可靠性有限(高變異性) | ★ 高靈敏度(低檢測極限) |
表格: EzDrop 與 EzCube 的組合提供了完整的樣本定量解決方案。
EzDrop與 EzCube的組合提供了完整的樣本定量解決方案。兩者可測量樣本的總量、純度和有效濃度,有助於降低 NGS失敗率,是 cfDNA前處理流程的理想組合。
若您正在進行 cfDNA相關的 NGS研究,建議採用以下樣本品質控制流程,以提高實驗成功率和數據品質:
此建議流程可應用於各種 cfDNA研究環境,為定序前品質控制提供結構化的方法。