首頁 服務支援 資源下載 定量與品質控制：次世代定序（NGS）應用細胞游離DNA（cfDNA）分析的關鍵考量

定量與品質控制：次世代定序（NGS）應用細胞游離DNA（cfDNA）分析的關鍵考量

NGS-Applications

準確的cfDNA定量是成功執行NGS流程的關鍵。本篇文章說明如何運用高靈敏與特異性的EzCube螢光定量儀來強化樣本品質控管，並提供將EzCube與EzDrop超微量分光光度計整合至cfDNA前處理和定序準備流程中的實務建議。

 

細胞游離DNA（cfDNA）於次世代定序 （NGS）中展現出高度潛力，特別是在癌症精準醫學領域。由於其具備非侵入性與即時監測的特性，使其成為腫瘤分子分析的重要工具。cfDNA可克服腫瘤異質性問題，提供較傳統組織切片更全面的腫瘤基因體資訊；當組織樣本稀少或難取得時，cfDNA亦可作為替代選項，大幅提升可採取治療行動的基因變異的檢出率。

 

然而，cfDNA的分析程序面臨許多挑戰，像是腫瘤DNA（ctDNA）於整體cfDNA中的比例極少（僅約0.01％-10％）。於技術層面，cfDNA樣本濃度可能極低且有高汙染風險。 為了應對這些挑戰，研究強調需要嚴謹的定量和品質控制（QC）以支持其在臨床實務中更廣泛的採用。

 

為什麼cfDNA NGS需要更高標準的定量和品質控制呢?

 

當執行cfDNA的NGS分析時，嚴格的定量與品質控制標準至關重要，主要原因在於cfDNA本身的特殊性質與技術挑戰。血漿中的cfDNA含量極低（通常為2-10 ng／mL），且短片段容易降解。若在NGS流程中無法準確控制樣本品質，可能會出現以下的問題：

 

  • 建庫失敗：由於cfDNA不足，建庫階段可能會失敗，造成後續聚合酶連鎖反應（PCR）擴增無法進行。
  • 定量誤差：定量不準確將導致建庫濃度估算出現偏差。基於cfDNA於大量的背景DNA中濃度極低（小於1 ng／μL），此類誤差可能造成定序過程中覆蓋過度或不足。
  • 數據偏差：約166bp片段型態對於品質評估非常重要。若樣本中存在高分子量基因組DNA（gDNA大於800bp）或其他雜質，將會嚴重影響定序比對 （mapping）效率與重複率，導致數據偏差。

為了克服上述難題，cfDNA的NGS流程必須具備極高的靈敏度和再現性。不僅要能準確定量極少量的核酸，還必須能偵測樣本降解與汙染，以確保定序數據的最高品質。傳統分光光度法雖然簡易、快速，可以提供樣本總濃度和純度的初步評估，但面對像cfDNA這類對雜質極為敏感的低濃度樣本時，其靈敏度與特異性往往不足。


因此，在研究和臨床實驗室中，越來越傾向採用更精密的檢測方法，尤其是搭配高靈敏度和高準確度的螢光定量儀（如EzCube）。此類儀器不僅可準確定量極低濃度的cfDNA，還能有效評估樣本完整性，為後續NGS建庫與定序提供可靠的品質控制，確保實驗結果的準確性與再現性。

 

EzCube螢光定量儀如何支援精確地處理cfDNA？

Blue-Ray-Biotech-EzCube-Fluorometer-and-EzQuant-Quantification-Kit

  • 高靈敏度與準確性：

EzCube螢光定量儀使用螢光染劑特異性與DNA／RNA結合，可處理極低濃度的樣本。在樣本僅每毫升數皮克的濃度中，仍能呈現高度準確且可重複的結果。特別適合用於NGS實驗中的樣本品質檢測。

 

  • DNA/RNA的特異性檢測：

如上所述，若樣本前處理過程中使用了較複雜的試劑，可能會干擾檢測反應。然而螢光法中使用的螢光染劑僅與DNA或RNA結合，結果不會受到蛋白質、鹽類或其他汙染物的影響，因此能更準確反映樣本中DNA/RNA的實際濃度。這種特異性有助於提高NGS樣本品質控制中定量檢測的可靠性。

 

  • 簡便快速的操作：

EzCube螢光定量儀直覺式的設計操作簡單，只需將樣本與螢光染劑混合後放入儀器，數秒內即可取得結果。即使是極低濃度的樣本，也能獲得非常準確且可靠的定量結果。高效率和便利的特性，使EzCube螢光定量儀成為NGS工作流程中檢測樣本品質的實用選擇。

 

雙重品質控制：EzCube與EzDrop的黃金組合


樣本前處理階段，僅靠單一儀器可能無法確保完美且快速地評估樣本濃度和純度。然而， EzDrop與EzCube的組合能為後續結果提供全面且可靠的支援：

 

  • EzDrop超微量分光光度計：一款快速、簡單且經濟實惠的核酸／蛋白定量工具，無需試劑即可檢測高濃度樣本（如雙股DNA 2-20,000 ng／μL），適用於初步定量與純度分析，並可檢測污染，這是樣本品質控制的關鍵（請見下表）
  • EzCube螢光定量儀：具備極高靈敏度（最低可測至 0.01 ng／μL）與特異性，可區分不同類型的核酸（雙股DNA／單股DNA／RNA）。需搭配使用的螢光試劑，是專為微量檢測與高精準實驗（如 NGS、qPCR）所設計。

 

 

Blue-Ray Biotech EzDrop 1000 Micro-Volume Spectrophotometer

Blue-Ray Biotech EzCube Fluorometer

品質控制功能

EzDrop超微量分光光度計

EzCube螢光定量儀

快速濃度檢測

★

即時檢測，無需試劑

-

精準雙股DNA定量

-

★

高特異性

純度評估 (A260／280 & A260／A230)

★

檢測汙染物

 （如蛋白質、溶劑）

-

低濃度檢測

-

 可靠性有限（高變異性）

★

高靈敏度（低檢測極限）

表格： EzDrop 與 EzCube 的組合提供了完整的樣本定量解決方案。

 

EzDrop與EzCube的組合提供了完整的樣本定量解決方案。兩者可測量樣本的總量、純度和有效濃度，有助於降低NGS失敗率，是cfDNA前處理流程的理想組合。

 

延伸閱讀：

分光光度計 vs 螢光定量儀：選擇適用的 DNA/RNA 定量工具

 

實驗建議： cfDNA液態切片流程的應用指南

 

若您正在進行cfDNA相關的NGS研究，建議採用以下樣本品質控制流程，以提高實驗成功率和數據品質：

 

  1. 使用EzDrop微量分光光度計，測量樣本於260nm波長的吸光值以評估核酸濃度，同時測量A260／A280和A260／A230的純度比值，確保樣本品質符合後續實驗需求。
  2. 使用EzCube螢光定量儀搭配不同類型的EzQuant試劑，可準確定量雙股DNA濃度，確保樣本達到建庫所需的起始量。此方法具有皮克級的高靈敏度，能有效區分惡性樣本與正常樣本之間的濃度差異。
  3. 建庫完成後，應使用毛細管電泳系統分析片段分布，必要時可透過qPCR驗證有效濃度，以確保定序品質。

此建議流程可應用於各種cfDNA研究環境，為定序前品質控制提供結構化的方法。


精準定量奠定NGS品質基礎


cfDNA樣本蘊含豐富的生物標記潛力，但分析過程充滿挑戰。為了獲得可靠的次世代定序結果，嚴格的定量工具和品質控制極為重要。EzCube螢光定量儀憑藉皮克級的檢測靈敏度和卓越的特異性，已成為低濃度cfDNA研究的關鍵工具；而EzDrop微量分光光度計可快速評估樣本的純度和總量，兩者相輔相成，建構完整的品質控制機制。


無論在基礎研究或臨床檢測中，樣本前處理階段的嚴格控制對確保後續NGS數據的可靠性至關重要。透過將精準定量與穩健的純度評估相結合，不僅可提升再現性，更能有效降低建庫失敗率和定序成本。

 

延伸閱讀：

全方位核酸品質控制——解決分子實驗後顧之憂

 

參考文獻

 

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  7. Blue-Ray Biotech. (n.d.). EzQuant Quantification Assay Kits. Retrieved from https://www.blue-raybio.com/en/category/product/EzQuant-Quantification-Assay-Kits

 

 

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